GUIÓN DE LA PRÁCTICA.
1. INTRODUCCIÓN.
Los pigmentos fotosintéticos son elementos indispensables en la absorción de luz y, por tanto, en la fotosíntesis. El más importante es la Clorofila a (Cla), de distribución universal en la fotosíntesis oxigénica. Además, los organismos fotosintéticos poseen una serie de “pigmentos accesorios” que participan, con la Cla del proceso de recepción de luz y transferencia de energía a los centros de reacción. El equipo pigmentario de las plantas vasculares terrestres contiene clorofila b (Clb) y carotenoides, además de Cla. La práctica tiene como objetivo extraer y cuantificar los tres tipos de pigmentos mencionados en plantas de la misma especie, pero sometidas a regímenes lumínicos diferentes para simular una adaptación a planta de sol y de sombra.
2. ¿CÓMO SE HACE?
· Extracción.
Antes de empezar se comprobará que todo el material a usar está seco. Si contiene gotas de agua o está húmedo es necesario secarlo cuidadosamente.
Se pesan aproximadamente 0.3 g de hoja, se cortan en trozos pequeños y se ponen en un mortero de cristal. Se añaden 10 mL de acetona neutralizada con MgCO3 y se macera el tejido aplastando y frotando, pero sin golpear. Una vez homogeneizado el tejido se filtra el extracto a través de un papel de filtro previamente humedecido con acetona neutralizada. El filtrado se recoge en una probeta. El volumen final de extracto debe llevarse a 15 mL y se almacena en un tubo de pigmentos, con tapón de rosca, para evitar que la acetona se evapore.
Este procedimiento debe realizarse una vez para la planta de sol y otra para la de sombra.
· Cuantificación.
Para cuantificar los pigmentos se mide, en un espectrofotómetro, la absorbancia del extracto a las siguientes longitudes de onda: 480 nm, que se usará para el cálculo de la concentración de carotenos; 645 y 663 nm que se usarán para el cálculo de la concentración de las clorofilas a y b y 750 nm para medir la turbidez de la muestra. Si ésta alcanzara un valor superior a 0.01 unidades de absorbancia (A) sería necesario diluir el extracto. Las concentraciones de pigmento, expresadas en μg mL-1 se calculan según las formulas de Hipkings y Baker, 1986:
Cla (μg mL-1)= 12.7 A (663) – 2.69 A (645)
Clb (μg mL-1)= 22.9 A (645) – 4.86 A (663)
Cl-total (μg mL-1)= 20.2 A (645) + 8.02 A (663)
Carotenos (μg mL-1)= 10 A (480)
3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN.
La concentración de pigmentos ha de expresarse en función del peso de la hoja utilizada en la extracción. Indica si se observan diferencias en los distintos pigmentos entre las plantas de sol y de sombra.
DESARROLLO DE LA PRÁCTICA.
1. INTRODUCCIÓN.
El presente informe sobre la segunda práctica de fisiología trata sobre extraer y cuantificar los pigmentos (Clorofila A, Clorofila B y carotenoides) que tienen 2 hojas de 2 tipos de plantas distintas: una planta de sombra y otra de sol. Posteriormente se comparará ambos resultados para ver si hay discrepancias.
2. MATERIAL Y MÉTODO.
- Hoja de planta de sol y otra hoja de planta de sombra.
- Mortero de cristal.
- Acetona.
- MgCO3.
- Papel de filtro.
- Probeta.
- Tubo de pigmentos.
- Espectrofotómetro.
- Pesa.
Se ha de comprobar que todo el material que se va a usar esta seco, si no lo estuviese, ha de secarse adecuadamente.
1. Se pesa 0.3 gramos de cada hoja y se colocan en el mortero de cristal.
2. Se añaden 10 ml de acetona previamente neutralizada con MgCO3, y se aplasta y frota las hojas hasta que esté totalmente homogéneo. Una vez que este homogéneo, se filtra a través de 2 capas de papel de filtro, que se recogerá en una probeta. El volumen final ha de ser de 15 ml, así que se irá añadiendo más acetona hasta alcanzar los 15ml necesarios. Se almacenará en un tubo de pigmentos que tenga un tapón de rosca, el cual evitará pérdidas de líquido por evaporación. Este paso se realizará para la planta de sol y para la planta de sombra.
Cuantificación:
3. Para realizar la cuantificación de los pigmentos que se quiere medir, es necesario el uso de un espectrofotómetro a diferentes longitudes de onda:
- 480 nm (para los carotenos).
- 645 nm (para la clorofila A).
- 663 nm (para la clorofila B).
- 750 nm (para medir la turbidez de la muestra).
Para esta última, si se alcanzaré un valor superior de 0.01 unidades de absorbancia (A) sería necesario diluir el extracto.
4. Para calcular las concentraciones de pigmento se usarían las formulas de Hipkings y Baker.
Cl A (µg m/L) = 12,7 A (663) -2,69 A (645)
Cl B (µg m/L) = 22,9 A (645) – 4,86 A (663)
Cl-Total (µg m/L) = 20,2 A (645)+ 8,02 A (663)
Carotenos (µg m/L) = 10 A (480)
3. RESULTADOS.
En general podemos decir que el resultado es el que esperábamos. Algunos grupos como en nuestro caso, obtenemos mayores concentraciones de carotenos en sombra que en sol. Esto ocurre debido a que los carotenos actúan como fotorreceptores complementarios en las plantas de sombra y por ello pueden encontrarse en mayor concentración que los que se encuentran como fotoprotectores en plantas de sol.
Todos los grupos excepto el 8 y el 3 obtuvieron mayores niveles de clorofila total en las plantas de sombra como cabía esperar. Estos dos grupos tuvieron que cometer algún tipo de error, sin embargo, no se han eliminado a la hora de hacer las medias, pues con el gran número de replicas que tenemos esto no afectaría al resultado final.
4. COMPROBACIÓN TEÓRICA.
A. La energía luminosa se mide y expresa cuantitativamente en unidades de luz: fotones.
En 1990, Max Planck enunció la teoría por la que toda transferencia de energía radiante de un objeto a otro implicaba unidades “discretas” de energía a las que llamó cuantos. Las ondas electromagnéticas son radiaciones y, por tanto, se transmiten de manera cuántica, en unidades discretas. La teoría cuántica de Planck se expresa matemáticamente como E=h·v, siendo E la energía de una unidad o partícula cuántica de radiación, v la frecuencia de la radiación (es decir, el número de ondas transmitido por unidad de tiempo) y h una constante.
La luz, como el resto de las radiaciones electromagnéticas, está compuesta de paquetes elementales de energía denominados fotones, de modo que un fotón individual interacciona con (es absorbido o emitido por) una molécula, y no se puede dar absorción o emisión de fracciones de fotones.
B. Los principales pigmentos fotosintéticos son las clorofilas (verdes) y los carotenoides (amarillo-anaranjados).
En las plantas, la luz destinada a impulsar el proceso fotosintético es absorbida por dos tipos de pigmentos: clorofilas y carotenoides, que son moléculas cromóforas sensibles a la radiación luminosa y genéricamente llamadas pigmentos fotosintéticos.
Estos pigmentos no están libres en el aparato fotosintético, sino que se encuentran engarzados dentro de las proteínas fotosintéticas formando los complejos pigmento-proteína. La asociación de estos pigmentos con polipéptidos es de tipo no covalente, por lo que al desnaturalizarse la proteína, se liberan los pigmentos.
El pigmento más importante es la clorofila, ya que es la biomolécula cromófora que interviene más directamente en el proceso de absorción y conversión de la energía luminosa. Existen distintos tipos de clorofilas, pero todos se caracterizan por tener un anillo tetrapirrólico cíclico, tipo porfirina con un catión metálico de magnesio ligado en el centro del anillo. Debido a esta estructura molecular, las clorofilas son capaces de absorber la radiación luminosa en la zona del azul y también en la zona del rojo; por ello son de color verde.
En vegetales, existen dos tipos de clorofilas diferentes, la clorofila a y la clorofila b. Habitualmente, todas las clorofilas están asociadas de modo no covalente a los polipéptidos constitutivos de las antenas. La principal función de las clorofilas es la absorción de luz en dichas antenas.
Los carotenoides son compuestos de cuarenta átomos de carbono (C40) que tienen una estructura principal lineal con grupos metilo laterales a cada 4 carbonos. Biosintéticamente, son derivados de la fusión de ocho unidades de isopreno (molécula de 5C).
Los carotenoides con algún grupo oxigenado se denominan xantofilas, mientras que los hidrocarburos son oxígeno son los carotenos. Los principales carotenoides presentes en todo cloroplasto vegetal son α-caroteno, β-caroteno y 5 xantofilas: luteína, violaxantina, anteraxantina, Zeaxantina y neoxantina.
Los carotenos son más abundantes, en general, en los centros de reacción de los Fotosistemas y las xantofilas son más abundantes en las antenas. La función fotosintética principal de los carotenoides es proteger al aparato fotosensible mediante mecanismos de disipación y extinción de energía. De modo secundario, también tienen la función de ser antenas alternativas, sobre todo en el espectro de luz entre 450 y 500 nm, en el cual las clorofilas absorben poco. Por absorber en esta zona del espectro, que corresponde a la luz azul-verde, los carotenoides de los cloroplastos son de colores amarillos y anaranjados.
C. Las clorofilas y los carotenoides son pigmentos que por su estructura molecular absorben muy eficazmente la luz.
Tanto las clorofilas como carotenoides poseen en su estructura sistemas de dobles enlaces conjugados que se extienden por gran parte de la molécula. La presencia de estos sistemas conjugados es lo que confiere a esos pigmentos su capacidad para absorber luz visible.
D. Las hojas son el órgano vegetal especializado en realizar la fotosíntesis.
La fotosíntesis en plantas superiores tiene lugar en tejidos fotosintéticos que se agrupan en su mayoría en órganos especializados. Estos órganos son las hojas. La luz solar es una radiación que se dispersa en toda la atmósfera terrestre; para aprovecharla al máximo, de ahí la gran superficie foliar que suelen tener los vegetales.
Las hojas son también, por esta razón, generalmente planas, como pequeños paneles solares que se pueden orientar a los rayos solares para tratar de absorber de modo óptimo toda la luz que necesitan.
5. REFLEXIÓN Y DISCUSIÓN.
El ambiente luminoso al que se encuentran expuestas las plantas afecta a su crecimiento y desarrollo y determina su morfología foliar y fisiología, sobreviviendo únicamente las plantas cuya fotosíntesis está adaptada a dichas condiciones de luz.
Cabe diferenciar dos tipos de adaptaciones: plantas de sol (heliófilas) y plantas de sombra (o esciófilas). Existen, asimismo, adaptaciones dentro de los árboles, encontrándose hojas de sol y de sombra en un mismo árbol que corresponden a emplazamientos soleados o sombreados, respectivamente.
Las hojas crecidas en condiciones de luz débil (hojas de sombra), aunque normalmente pueden tener mayor superficie que las desarrolladas con luz intensa (hojas de sol), son más delgadas debido a que poseen menos capas de células del mesófilo en empalizada, células más cortas y menor peso por unidad de área foliar.
La epidermis, el mesófilo esponjoso y los sistemas vasculares están más desarrollados en las hojas de sol. También existen diferencias en el aparato fotosintético: las hojas de sombra poseen más grana por cloroplastos y un mayor número de tilacoides apilados por grana que las de sol.
Asimismo, las plantas de sombra poseen mayor número de pigmentos en las antenas de los Fotosistemas (especialmente, clorofila b) con el fin de aprovechar mejor la escasa irradiancia incidente. Ello se refleja en un descenso de la relación clorofila a/ clorofila b desde valores de 4-5 en hojas de plantas crecidas a pleno sol hasta valores de 2,5, típicos de hojas de plena sombra.
Las hojas más gruesas de plantas de sol poseen un mayor contenido en clorofila total y carotenos por unidad de área, mientras que las de sombra, más finas y con un peso seco relativamente bajo, contienen más clorofilas por unidad de peso fresco o peso seco, en especial clorofila b.
Fuentes jajaja
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